Получение рекомбинантного белка сибиреязвенного бактериолизина PlyPH и исследование in vitro его литических свойств в отношении микробных клеток Bacillus anthracis

Возбудитель сибирской язвы – Bacillus anthracis, вследствие распространенности его природных очагов на территории России, высокой вирулентности для человека и большинства млекопитающих, уникальной устойчивости споровых форм к воздействию факторов окружающей среды и неоднократного применения в террористических актах, представляет собой крайне опасный биологический агент. Поэтому необходим поиск новых эффективных препаратов для диагностики и лечения сибирской язвы, в том числе и заболеваний, вызванных антибиотико-устойчивыми штаммами B. anthracis. Новым направлением в диагностике, профилактике и лечении инфекционных заболеваний является использование литических ферментов видоспецифических бактериофагов. Цель работы – клонирование гена сибиреязвенного бактериолизина PlyPH в составе вектора pTrcHis2C в Escherichia coli и исследование in vitro литических свойств кодируемого им белка в отношении микробных клеток B. anthracis. По данным полного секвенирования геномов B. anthracis штаммов Ames, Stern 34F2 и JB17 был выявлен в составе их хромосомной ДНК профаг, утративший часть структурных генов, необходимых для его репликации, но сохранивший ген, имеющий высокую степенью гомологии с геном бактериолизина γ фага. Для амплификации и последующего клонирования гена PlyPH нами были разработаны праймеры, содержащие сайты узнавания рестриктаз EcoRI и BamHI. Амплификацию гена PlyPH в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с разработанной парой праймеров проводили, используя в качестве матрицы ДНК штамма Stern 34F2 сибиреязвенного микроба. На основе полученных продуктов амплификации и вектора pTrcHis2C нами сконструирована рекомбинантная плазмида, содержащая ген PlyPH синтеза бактериолизина и стабильно функционирующая в клетках рекомбинантного штамма E. coli. В ходе исследований установлено, что микробные клетки рекомбинантного штамма TOP10 E. coli обеспечивают продукцию бактериолизина сибиреязвенного профага − PlyPH, обладающего способностью in vitro лизировать вегетативные клетки вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1.

1. Бургасов П.Н., Черкасский Б.Л., Марчук Л.М. и др. Сибирская язва. М.: Медицина, 1970.

2. Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В. и др. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики. М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999.

3. Онищенко Г.Г. Инфекционные болезни – важнейший фактор биоопасности // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2003. № 3. С. 4–16.

4. Онищенко Г.Г., Федоров Ю.М., Тихонов Н.Г. и др. Противодействие биотерроризму как новая проблема эпидемиологии // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2003. № 2. С. 4–6.

5. Inglesby T.V., Henderson D., Bartlett J.G. et al. Anthrax as a biological weapon. Updated recommendations for management // JAMA. 2002. V. 287. P. 2236–2252.

6. Pile J.C., Malone J.D., Eitzen E.M. et al. Anthrax as a potential biological warfare agent // Arch. Int. Med. 1998. V. 158. P. 429–434.

7. Young R. Bacteriophage lysis: mechanism and regulation // Microbiol. Rev. 1992. V. 56, № 3. P. 430–481.

8. Cheng Q., Nelson D., ZhuS. et al. Removal of group B streptococci colonizing the vagina and oropharynx of mice with a bacteriophage lytic enzyme // Antimicrobial Agents Chemotherapy. 2005. V. 49, № 1. P. 111–117.

9. Jado I., Lopez R., Garcia E. et al. Phage lytic enzymes as therapy for antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae infection in a murine sepsis model // Antimicrobial Agents Chemotherapy. 2003. V. 52, № 6. P. 967–973.

10. Schuch R., Nelson D., Fischetti V.A. A bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis // Nature. 2002. V. 418, № 22. P. 884–888.

11. Yoong P., Schuch R., Nelson D. et al. PlyPH, a bacteriolytic enzyme with a broad pH range of activity and lytic action against Bacillus anthracis // J. Bacteriol. 2006. V. 188, № 7. P. 2711–2714.

12. Маниатис Т., Фрич Э., Самбрук Дж. Молекулярное клонирование: пер. с англ. М.: Мир, 1984.